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目的：通過此教程，了解Discovery Studio中基于蛋白序列構(gòu)建同源跨膜蛋白模型的操作方法及結(jié)果分析。

所需功能和模塊：Discovery Studio Client，DS Sequence Analysis，DS MODELER，DS Protein Families。

所需數(shù)據(jù)文件：2rh1.pdb，ADRB1_HUMAN.fasta。

(相關(guān)資料圖)

所需時(shí)間：0.5小時(shí)

介紹

膜蛋白在藥物研發(fā)領(lǐng)域中是一類非常重要的靶標(biāo)蛋白，這是由于該類蛋白，尤其是GPCR（G蛋白偶聯(lián)受體），是目前許多已知藥物以及仍處于研發(fā)階段的大量藥物分子的目標(biāo)靶點(diǎn)。GPCR是一類七次跨膜受體蛋白，它們廣泛地參與細(xì)胞增殖、分化、遷移，尤其是各類生理活動(dòng)的調(diào)控。從近幾十年藥物發(fā)展的歷史看，全球70%所開發(fā)的藥物都是針對(duì)GPCR的，因此GPCR是令人矚目的藥物治療靶點(diǎn)。

本教程即演示了如何使用DS中已有的一系列工具（tools）和流程（protocols），以beta-2腎上腺素受體X-衍射晶體結(jié)構(gòu)為模板，來構(gòu)建beta-1腎上腺素受體的同源模型并進(jìn)行加膜處理。

本教程包括以下步驟：

輸入beta-1腎上腺素受體的序列及beta-2腎上腺素受體模板結(jié)構(gòu)

預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)

將目標(biāo)序列比對(duì)至模板序列

構(gòu)建3D同源模型

添加隱性生物膜至構(gòu)建得到的模型

調(diào)整生物膜的位置

打開輸入文件

在文件瀏覽器（Files Explorer）中，展開Samples | Tutorials | Protein Modeling文件夾，雙擊打開ADRB1_HUMAN.fasta序列文件。

這將在一個(gè)名稱為ADRB1_HUMAN新的序列窗口中打開beta-1腎上腺素受體的一級(jí)序列（序列名為ADRB1_HUMAN）。

構(gòu)建同源模型的第一步是識(shí)別合適的模板。如果同目標(biāo)序列的序列一致性較高的模板存在，通?？梢酝ㄟ^簡單的BLAST搜索得到該模板結(jié)構(gòu)。對(duì)于膜蛋白而言，X-單晶衍射解析得到的晶體結(jié)構(gòu)非常有限，因此本教程不包含模板識(shí)別這一步驟（該步驟細(xì)節(jié)可以參看MODELLER教程）。

本教程采用最近解析出來的beta-2腎上腺素受體晶體結(jié)構(gòu)（PDB號(hào)：2rh1）作為模板。

在文件瀏覽器（Files Explorer）中，展開Samples | Tutorials | Protein Modeling文件夾，雙擊打開2rh1.pdb文件。

蛋白2rh1.pdb在分子窗口中顯示。

注：采用BLAST搜索PDB_nr95數(shù)據(jù)庫可以找到另一個(gè)可能的模板，火雞beta-1腎上腺素受體。該晶體結(jié)構(gòu)同目標(biāo)序列的序列一致性高達(dá)70.5%，是一個(gè)比較好的模板結(jié)構(gòu)。然而，本教程采用2rh1作為模板是想突出DS的功能，因?yàn)樵谀０逍蛄幸恢滦匀绱烁叩那闆r下，軟件功能在很大程度上是不太相關(guān)的。

建模的下一步：將目標(biāo)序列與模板序列進(jìn)行序列比對(duì)。首先需要將目標(biāo)序列和模板序列置于同一個(gè)序列窗口當(dāng)中。

點(diǎn)擊激活A(yù)DRB1_HUMAN序列窗口。

在窗口中點(diǎn)擊右鍵選擇Insert Sequence | From Windows…

打開Insert Sequence from Windows對(duì)話框。

選擇2rh1點(diǎn)擊OK。

將2rh1序列插入ADRB1_HUMAN序列窗口當(dāng)中。

注：此時(shí)兩序列并未進(jìn)行比對(duì)，狀態(tài)欄（DS窗口左下角）顯示了兩序列之間的序列一致性及相似性情況（分別為7.0%，27.4%）。

預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)

序列比對(duì)流程允許利用蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息來提高序列比對(duì)的精度。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，如DSC，是基于球蛋白的溶劑暴露模式來定義的。膜蛋白的表面大部分都暴露于生物膜內(nèi)部的脂質(zhì)環(huán)境中而非水環(huán)境。這就導(dǎo)致了氨基酸序列中疏水殘基和親水殘基模式的不同，從而使得標(biāo)準(zhǔn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法來預(yù)測膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)不太可靠。本教程則采用專門用于預(yù)測膜蛋白螺旋區(qū)的的TransMem方法。

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Analyze Transmembrane Proteins，點(diǎn)擊Predict Transmembrane Helices。

在ADRB1_HUMAN序列窗口中相應(yīng)地添加了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)卡通圖，紅色橫條表示alpha-螺旋，藍(lán)色箭頭表示beta-折疊。（圖1）

圖1

注：預(yù)測2rh1的跨膜螺旋時(shí)，有一段區(qū)域（ASN1002—TYR1161）是沒有預(yù)測到螺旋結(jié)構(gòu)的。該區(qū)域?qū)?yīng)的是一個(gè)為方便結(jié)晶與β-2腎上腺素受體融合的溶菌酶的序列。標(biāo)準(zhǔn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法可以預(yù)測出該區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如果將二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果用于指導(dǎo)序列比對(duì)，如此大的序列插入會(huì)擾亂比對(duì)的結(jié)果。

將目標(biāo)序列與模板序列進(jìn)行比對(duì)

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Align Sequence and Structures，點(diǎn)擊Align Sequences…打開Align Sequences對(duì)話框。

確保Input Sequence Set設(shè)置為ADRB1_HUMAN:All。

點(diǎn)擊Use Secondary Structures右邊的下拉菜單，選擇TRANSMEM。（圖2）

點(diǎn)擊Run運(yùn)行作業(yè)，等待作業(yè)完成。

該作業(yè)大概需要1.5min的時(shí)間（奔騰4，3GHz的CPU，1GB的存儲(chǔ)器）。

作業(yè)完成以后，ADRB1_HUMAN序列窗口會(huì)自動(dòng)更新為序列比對(duì)之后的結(jié)果（圖3），同時(shí)彈出序列一致性和序列相似性（42.1%，53.3%）報(bào)告的對(duì)話框（圖3）。

點(diǎn)擊OK關(guān)閉該對(duì)話框。

圖2 “Align Sequences”參數(shù)設(shè)置

圖3

構(gòu)建目標(biāo)序列的3D同源模型

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Create Homology Models，點(diǎn)擊Build Homology Models，打開Build Homology Models對(duì)話框。

點(diǎn)擊Input Sequence Alignment右邊的柵格，下拉列表中選取ADRB1_HUMAN:All。

點(diǎn)擊Input Templates Structures一欄，選擇2rh1。

點(diǎn)擊Input Model Sequence右邊的柵格，下拉列表中選取ADRB1_HUMAN。

展開Copy From Templates參數(shù)欄，點(diǎn)擊Ligands參數(shù)欄，選擇2rh1:A:CLR412，2rh1:A:CLR413，2rh1:A:CLR414，2rh1:A:PLM415。

該步驟將棕櫚酸和膽固醇分子從模板結(jié)構(gòu)中直接復(fù)制到模型結(jié)構(gòu)當(dāng)中。這些分子有助于決定生物膜相對(duì)于模型結(jié)構(gòu)的位置。

將Number of Models設(shè)為1。

點(diǎn)擊Optimization Level右邊的柵格，下拉列表中選取Low。（圖4）

注：將Optimization Level由默認(rèn)值改為Low，可以加快計(jì)算速度，但產(chǎn)生的模型的精度會(huì)下降。

圖4 “Build Homology Models”參數(shù)設(shè)置

點(diǎn)擊Run運(yùn)行該作業(yè)。

該作業(yè)大概需要1min的時(shí)間（奔騰4，3GHz的CPU，1GB的存儲(chǔ)器）。

待作業(yè)完成以后，構(gòu)建得到的模型在名為ADRB1_HUMAN的分子窗口中打開（圖5），同時(shí)有一個(gè)報(bào)告PDF Total Energy的對(duì)話框彈出。

點(diǎn)擊OK關(guān)閉該對(duì)話框。

圖5

給模型添加隱性生物膜結(jié)構(gòu)

DS為用戶提供了為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)添加和控制隱性膜結(jié)構(gòu)的工具。該膜結(jié)構(gòu)的位置可以用在模擬（simulation）流程中以明確蛋白質(zhì)在隱性溶劑模型中的溶劑化性質(zhì)。

在菜單欄中，選擇Edit | Preferences…以顯示 Preferences 對(duì)話框。

在Transmembrane Protein 頁面中, 確保Membrane Thickness的設(shè)置為30 ?（圖6）。

點(diǎn)擊OK關(guān)閉Preferences對(duì)話框。

這里所說的Membrane thickness指的是膜的疏水區(qū)，不包括磷脂的極性頭部所占據(jù)的區(qū)域。

圖6

點(diǎn)擊并激活A(yù)DRB1_HUMAN分子窗口。

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Analyze Transmembrane Proteins，在Create and Edit Membrane欄下點(diǎn)擊Add。

該步將為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)添加一個(gè)膜結(jié)構(gòu)。該膜在分子窗口的圖形界面上以兩個(gè)平行的平板表示（圖7）。

圖7

調(diào)整膜的位置

Add命令只使用一個(gè)非常簡單的溶劑模型來確定膜結(jié)構(gòu)的位置。做這樣的優(yōu)化處理更多地是考慮到了速度而非精度。因此，通常都需要對(duì)膜的位置進(jìn)行重新調(diào)整。

在系統(tǒng)（Hierarchy）視圖中，展開ADRB1_HUMAN.M0001,點(diǎn)擊選中B鏈以選中模型中的膽固醇和棕櫚酸分子。

注意到，膽固醇和棕櫚酸分子的極性區(qū)域都處于以兩個(gè)平板所定義的膜結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)(圖8)。這表明初始構(gòu)建的膜的位置需要調(diào)整。

使用Add Membrane and Orient Molecule流程可以自動(dòng)完成上述膜結(jié)構(gòu)位置的調(diào)整過程。該protocol使用廣義伯恩（GB）溶劑模型對(duì)膜的位置進(jìn)行全面優(yōu)化。由于此步計(jì)算需要非常長的計(jì)算時(shí)間，所以本教程使用Analyze Transmembrane Proteins工具面板來調(diào)整膜結(jié)構(gòu)的位置。

在系統(tǒng)（Hierarchy）視圖中，展開ADRB1_HUMAN.M0001,點(diǎn)擊選中A鏈。

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Analyze Transmembrane Proteins，在Create and Edit Membrane欄下點(diǎn)擊Add Orientation Monitor。

這將在模型結(jié)構(gòu)窗口中添加一個(gè)膜取向調(diào)節(jié)坐標(biāo)（membrane orientation monitor），用以指示膜與蛋白質(zhì)主軸間的移動(dòng)（shift），傾斜（tilt）及旋轉(zhuǎn)（rotation）角度（圖8）。

圖8

點(diǎn)擊Modify…

打開Edit Membrane對(duì)話框。

設(shè)定Shift為4.8 ?，Tilt 為15.5度，Rotation 為30.0度。

點(diǎn)擊OK。

點(diǎn)擊3D窗口中任一位置，從而不選中蛋白質(zhì)。

在菜單中Display Style中選擇第一種表示方式.

調(diào)整后的膜結(jié)構(gòu)中，膽固醇和棕櫚酸分子的極性區(qū)都位于生物膜疏水區(qū)的外側(cè)（圖9）。

圖9